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双光子激发显微镜
资料介绍
一、基本概念与原理
双光子激发显微镜（Two-Photon Excitation Microscopy，简称2PE或2PM）是一种非线性光学成像技术，基于多光子吸收效应实现生物组织等高散射样本的深度成像。其核心原理是：荧光分子同时吸收两个能量较低的长波长光子（通常为近红外波段），跃迁至激发态后返回基态时发射出波长更短的荧光，实现对样本的标记成像。
与传统单光子激发荧光显微镜相比，双光子激发具有两个核心特点：
1. 非线性激发局限：只有在聚焦焦点处，光子密度足够高的区域才能发生双光子吸收，焦平面外的区域几乎不会产生激发，天然具备光学层切能力，无需额外的共焦针孔即可实现三维成像。
2. 近红外光优势：使用的长波长近红外光相比可见光，在生物组织中的散射更低、吸收更少，能够穿透更深的样本组织，同时降低了光漂白和光毒性对活样本的损伤。
二、发展历史
双光子吸收效应早在1931年就由德国物理学家玛丽亚·格佩特-迈耶（Maria Göppert-Mayer）从理论上预测提出，但受限于当时没有高能量密度的脉冲激光光源，直到1961年才在实验室中被实验验证。1990年，康奈尔大学的Winfried Denk等人首次将双光子吸收与激光扫描显微镜结合，成功研制出世界第一台双光子激发扫描显微镜，开启了双光子成像在生物医学领域的应用序幕。
此后随着飞秒激光技术、近红外探测器、新型荧光探针的发展，2PE技术不断迭代，从最初的点扫描成像发展出宽场双光子显微镜、双光子荧光寿命成像、结合自适应光学的大深度高分辨率成像等多种衍生技术，应用范围也从神经科学拓展到肿瘤学、发育生物学、药物研发等多个领域。
三、系统构成
典型的双光子激发显微镜系统主要由以下几个核心部分组成：
1. 飞秒脉冲激光光源：是双光子激发的核心组件，要求能够输出高脉冲能量、高重复频率的近红外飞秒脉冲（通常脉宽为100~200 fs，重复频率为70~100 MHz，波长范围700~1100 nm，覆盖大部分常用荧光探针的双光子吸收峰），目前常用的是钛蓝宝石飞秒激光器，也有光纤飞秒激光器等更紧凑的商业化方案。
2. 扫描系统：通常采用振镜扫描实现对样本的逐点逐行扫描，通过控制振镜的偏转改变激光聚焦位置，完成整个感兴趣区域的成像；也有使用多光子点阵扫描、线扫描等方案提升成像速度。
3. 显微光学系统：包括物镜、管镜等聚焦光学元件，要求物镜对近红外光具有高透过率、大数值孔径，保证激光的聚焦效率和荧光收集效率。
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