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频域CARS显微镜原理
资料介绍
一、CARS显微技术基本概念
相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering,CARS)显微技术是一种基于非线性拉曼效应的无标记光学成像技术,相比于传统荧光成像,CARS不需要对样品进行荧光标记,避免了标记过程对样品活性的干扰,同时克服了荧光漂白问题,适合对生物样品进行长时间动态观测。
按照信号采集方式的不同,CARS显微镜可以分为时域CARS和频域CARS两大类。其中,频域CARS通过宽带光源同时激发多个振动模式,在频域维度分离不同化学键的拉曼信号,能够实现多组分同时成像和高光谱采集,近年来得到了快速发展。
二、频域CARS显微镜的基本原理
2.1 相干反斯托克斯拉曼散射的物理基础
CARS过程需要两束相干激光,分别为泵浦光(频率ωp)和斯托克斯光(频率ωs)。当两束光同时聚焦到样品上时,若两束光的频率差Δω=ωp-ωs等于样品分子某一振动模式的固有频率Ω,就会产生共振增强的四波混频效应,生成频率为ωas=2ωp-ωs的相干反斯托克斯信号。相比于自发拉曼散射,CARS信号强度高出几个数量级,且信号具有相干性,可以通过透镜收集实现聚焦成像,成像速度远高于自发拉曼成像。
2.2 频域维度的信号分离机制
与时域CARS采用窄线宽激光逐点扫描激发不同振动频率的方式不同,频域CARS利用宽带泵浦光或宽带斯托克斯光,一次激发就能覆盖宽范围的拉曼频移区间,所有共振的振动模式都会产生对应的CARS信号,之后通过光谱仪将不同频率的反斯托克斯信号在频域维度分开,每个像素点都能得到完整的CARS光谱,进而根据不同化学键的特征拉曼峰区分样品组分,实现多色成像。
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