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实时荧光定量PCR探针技术概述.
资料介绍
一、探针的基本定义与作用
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）探针是一种在PCR反应体系中用于特异性检测靶标核酸序列的寡核苷酸分子。其核心功能是通过与扩增产物的特异性结合，在PCR过程中实时释放荧光信号，实现对模板DNA/RNA的定量分析。与SYBR Green等非特异性染料相比，探针技术具有更高的序列特异性和检测灵敏度，可有效避免非特异性扩增产物（如引物二聚体）的干扰。
二、探针的化学结构与分类
（一）TaqMan探针
1. 结构特点：5'端标记荧光报告基团（如FAM、VIC、HEX），3'端标记荧光淬灭基团（如TAMRA、BHQ），探针长度通常为20-30 nt，Tm值比引物高5-10℃。
2. 工作原理：PCR延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性将与靶序列结合的探针水解，使报告基团与淬灭基团分离，荧光信号释放。荧光强度与扩增产物量成正比。
3. 优势：特异性高，背景信号低，支持多重检测（多色探针组合）。
4. 局限性：设计难度较高，需避免二级结构；成本高于染料法。
（二）分子信标（Molecular Beacons）
1. 结构特点：茎环结构，环部为靶序列互补区（15-30 nt），茎部为互补的短序列（5-7 nt）；5'端标记报告基团，3'端标记淬灭基团（如DABCYL）。
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