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高通量筛选CRISPR技术研究进展
资料介绍
一、技术概述
CRISPR-Cas9系统是源于细菌和古菌适应性免疫系统的基因编辑工具，依靠向导RNA（gRNA）识别特定基因组序列，引导Cas核酸酶切割靶位点产生DNA双链断裂，通过细胞内源性修复机制实现基因敲除、碱基编辑、基因插入等多种修饰。随着功能基因组学研究对大规模基因功能分析需求的提升，将CRISPR技术与高通量筛选策略结合，形成了高通量筛选CRISPR技术，可在全基因组范围内快速鉴定基因功能，筛选与特定表型相关的关键基因，成为当前生命科学和生物医药领域的核心技术之一。
相较于传统的基因筛选方法，如RNA干扰（RNAi）筛选，高通量CRISPR筛选具有明显优势：首先，CRISPR技术实现的是DNA水平的永久修饰，而RNAi仅在转录后水平抑制基因表达，存在敲低不完全、脱靶效应比例较高的问题，CRISPR筛选的结果更为稳定可靠；其次，CRISPR系统可兼容多种修饰类型，不仅可以完成基因敲除筛选，还可实现基因激活、基因抑制、碱基编辑等多种筛选，覆盖了更广泛的研究场景；第三，随着高通量测序和寡核苷酸合成技术的发展，一次性构建覆盖全基因组的gRNA文库成本大幅降低，筛选通量可达到全基因组水平，能够一次性完成数万基因的功能分析，大幅提升了筛选效率。
二、高通量CRISPR筛选的技术体系
2.1 gRNA文库构建
gRNA文库是高通量CRISPR筛选的核心基础，根据筛选目标的不同，可分为全基因组文库和靶向文库两类。全基因组文库覆盖人类或小鼠等模式生物的全部编码基因，一般每个基因设计3-10条不同的gRNA，保证对靶基因的编辑效率，一个典型的人类全基因组CRISPR敲除文库包含约10-20万条不同的gRNA序列。靶向文库则针对特定基因集合设计，比如针对所有激酶、G蛋白偶联受体或者癌症相关基因构建文库，文库规模更小，筛选深度更高，适合针对性的功能研究。
gRNA的设计需要综合考虑编辑效率和脱靶风险，当前已有多种成熟的设计算法，通过分析靶序列的GC含量、PAM位点邻近序列特征、基因组脱靶位点数量等参数，筛选出编辑效率高、脱靶概率低的gRNA序列。寡核苷酸芯片合成技术可以一次性合成数十万条不同的寡核苷酸序列，经PCR扩增后克隆到慢病毒或者质粒载体中，完成文库构建。当前多个研究团队已经构建了成熟的公共gRNA文库，比如GeCKO文库、Brunello文库等，研究者可以直接使用，不需要自行构建，大幅降低了技术门槛。
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