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基于主客体竞争模式的凝血酶适配体传感器的研究

更新时间：2019-12-25 11:42:50 大小：996K 上传用户：zhiyao6 查看TA发布的资源 标签：传感器 下载积分：1分评价赚积分（如何评价?）打赏收藏评论(0) 举报

资料介绍

基于β-环糊精（β-CD）主客体竞争模式,构建了开关型凝血酶适配体电化学传感器。将末端修饰了二茂铁（Fc）的核酸适配体通过与β-CD的主客体识别固定在金电极表面,当凝血酶存在时,适配体由原来的直立线状构型变为“G-四链体”,远离电极表面,适配体探针的氧化还原电流强度减小,即“Signal-off”。利用此效应对凝血酶进行了灵敏检测,结果表明,在5.0×10-135.0×10-9mol/L浓度范围内,凝血酶的浓度与电化学响应信号呈良好的线性关系,检出限为2.0×10-13mol/L（3σ）。与其它蛋白分子相比,本方法对凝血酶蛋白的检测具有高特异性。本传感器构建简单,再生性好,为生物血清样本中凝血酶的实时高效检测提供了方法。

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( FENXI HUAXUE)

第期

第

卷

分析化学

研究报告

2017

Chinese Journal of Analytical Chemistry

1421～1426

年

月

DOI: 10．11895/j．issn．0253-3820．170268

檵檵檵檵檵檵檵

殝

研究报告

殝

檵檵檵檵檵檵檵

基于主客体竞争模式的凝血酶适配体传感器的研究

姚雪莲陈查丹张晶崔汉峰林艳洪年何玲玲

孔德荣樊浩程林

(

，

江西中医药大学药学院南昌

330004)

- (

基于 β 环糊精 β

-CD)

，。

主客体竞争模式构建了开关型凝血酶适配体电化学传感器将末端修饰了

摘

要

( Fc)

-CD

，，

的主客体识别固定在金电极表面当凝血酶存在时适配体由原来的

二茂铁

的核酸适配体通过与 β

“G- ”，，， “Signal-off”。

直立线状构型变为四链体远离电极表面适配体探针的氧化还原电流强度减小即利用

， 5．0 10 ～ 5．0 10 mol/L

，

浓度范围内凝血酶的浓度与电化

此效应对凝血酶进行了灵敏检测结果表明在

2．0 10 mol/L( 3 ) 。，

与其它蛋白分子相比本方法对凝血酶蛋白

，

学响应信号呈良好的线性关系检出限为

。，，

的检测具有高特异性本传感器构建简单再生性好为生物血清样本中凝血酶的实时高效检测提供了方法

。

- ; ; ; ;

关键词 β 环糊精主客体识别适配体凝血酶竞争

引言

，、、、、

凝血酶是一种重要的凝血系统丝氨酸蛋白酶在伤口愈合血管止血炎症组织黏合动脉硬化等

［1，2］

。

，，，

此外凝血酶对肿瘤细胞的生长具有调节作用浓度较低时促进生长浓

过程中发挥了重要作用

［3］

，

度较高时抑制其生长甚至产生凋亡效应

，

在激活正常细胞的致瘤性和恶性细胞转移方面也扮演着

［4，5］

。

，，、

凝血酶含量是衡量机体凝血功能异常一种指标因此建立灵敏快速检测凝血酶的方

重要角色

法对疾病诊断具有重要意义

( Aptamer)

。

、

，

、

适配体

可与目标物高特异性高选择性结合具有易合成易修饰高稳定性配体广泛

［6］

［7～12］

、

无免疫原性易储存等优点

，

。

基于适配体的传感方法近年来得到广泛应用

很多文献报道了利

等设计了一种三明治型凝血酶适配体电化学传感

Pt NPs/

［13～19］

［20］

。Gao

用适配体构建的凝血酶电化学传感器

，

器将巯基化的一条适配体固定在金电极表面形成适配体凝血酶复合物并与另一条修饰了

CNCs ， H O

的适配体结合通过纳米粒子催化

，，

的电化学还原产生阴极电流对凝血酶实现放大检测检

［21］

1．0 10 mol/L。Wang

au@ GS CoPd NPs，

和用巯基标记的探针作为

出限为

等

基于金纳米粒修饰的

，，

捕获探针生物素标记的探针作为报道探针形成的夹层结构对凝血酶的检出限低至

5 pg /mL。

这些方

，，。

法虽然能有效放大信号但是检测过程中需多步识别操作过程复杂有研究者利用电活性标记物在电

［22］

［23］

“Signal-on”

极表面的电子传递构建了开关型凝血酶电化学传感器如

， Radi

Katakis

等将标记

和

，， “G- ”

的适配体通过巯基固定在金电极表面适配体与凝血酶结合后形成刚性的四链体结构而靠近电

［24］

，，

极表面电化学信号增大从而实现对凝血酶的检测

。Xiao

，

等

设计了同样检测原理的凝血酶传感器

，

( MB) ，

，

利用适配体凝血酶的特异性结合使适配体上标记的亚甲基蓝

与电极表面接近使信号增强

270%。

此类传感器是通过与凝血酶识别前后标记物与

2．56 10 mol/L

的凝血酶响应信号约为空白的

，，

电极表面距离发生的改变而导致电信号的改变进行测定虽然构建简便但电化学标识物的电子传递受

，

到了适配体链长度的限制因而对灵敏度有所影响

。

，

环糊精是直链淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶作用下所生成的系列环状低聚糖的总称通常含

6～12

D- ，

吡喃葡萄糖单元其中 β

-CD

7 。

是研究较多的含有个葡萄糖单元的分子环糊精分子具有类似锥

个

2017-04-30

; 2017-08-05

收稿

接受

( No．81660658)

( No．20161BAB215212)

资助项目

本文系国家自然科学基金

* E-mail: lincheng_2003@ 126．com

和江西省青年自然科学基金

卷

分析化学

第

1422

，。

形的中空圆筒腔体结构内部是疏水空腔而外部是亲水环形其特殊的腔体结构使得环糊精具有突出

，、，

的识别和包络客体分子的能力如有机分子无机离子等这种主客体间的识别作用能使分子形成良好

［25］

，、、、

组装体系在医药分析化工环保等研究领域受到广泛关注

。

-CD

与

本研究利用 β

的主客体识

标记的抗凝血酶适

， “Signal-off” ，

别原理构建了一种的开关型适配体传感器用于凝血酶的检测

。3'

-CD

-CD ( 1) ，

的电极表面实验原理见图在凝血酶不存在

配体利用 β

与

客体的识别作用组装到修饰 β

，

; ，，

在电极表面发生氧化还原给出电化学响应信号凝血酶存在时与适配体特异性结合适配

时由于

，

体构型发生改变离开电极表面电子传递受阻

，

。，

信号减弱本方法中适配体与凝血酶结合后标

ꢀPV

DPV

，

记物直接脱离电极表面检测信号不受适配体链

，

长度的影响因此灵敏度高

。

ꢁ

Thrombin

实验部分

茁鄄CD

2．1

3′鄄Fc鄄Anti鄄thrombin aptamer

仪器与试剂

AUTOLAB

(

电化学工作站瑞士万通仪器有限

图

基于分子识别机理的凝血酶适配体电化学传感器

) ; : ( 1．0 mm)

公司采用三电极体系金电极直径为

示意图

，Ag /AgCl

(

电极饱和

KCl)

，

为参比电极

工作电极

铂电极为对电极

Bruker

Fig．1 Schematic illustration of thrombin aptamer electro-

chemical sensor based on principal of molecular recognition

; 400 MHz

(

核磁共振波谱仪瑞士

) 。

科技有限公司

-CD( Sigma-Aldrich

) ; 、

公司凝血酶牛血清白蛋白

( BSA) 、 ( ( )

溶血酶生工生物工程上海股份有限

) ;

公司核酸适配体序列

: 3'-Fc-GGTTGGTGTGGTTGG-5'(

) ;

大连宝生物工程有限公司所用试剂均为分

， (

析纯实验用水为超纯水美国

Millipore

) 。

公司超纯水系统制备

2．2 SH- -CD

的合成

［26］， -CD ( 1．10 g，1．0 mmoL)

参照文献将 β

( 5．20 g，20 mmoL)

( 5．05 g，

和碘

加入含三苯基膦

20 mmoL)

20 mL

( DMF)

，

中混合体系在氮气保护下

80℃

15 h，

将反应液浓缩

的

二甲基甲酰胺

磁力搅拌

pH 9．0 ～ 10．0，

再加入甲醇钠的甲醇溶液

1 /2，

使得

( 3 moL，8．0 mL)

，

中冷却后在室温下放置

约

30 min，，

以破坏在反应中形成的酯类加入

100 mL

500 mL

，，

冰水环境下产生沉淀收集沉淀用

冰甲醇和

，

冰水和甲醇冲洗干燥后得到白色粉末

( 6-I- -CD) ( 1．56 g，82%) 。

6-I- -CD( 1．56 g，0．82 mmoL) 、

( 0．48 g，6．4 mmoL)

16 mL DMF

， 70℃

中氮气保护下反

取

硫脲

溶于

19 h

，

后减压除去

DMF，

再加入

NaOH( 0．42 g，1．05 mmol/L) ，

氮气氛下加热回流

1 h ，

后用水合

应

KHSO

，，

过滤沉淀用蒸馏水洗涤干燥除去残留的

DMF。

NaOH

，

使澄清加

在得到的悬浮液中加入少量

KHSO

，

产生沉淀经过滤真空干燥后得到白色粉末

( 0．85 g，83%) ， 6-SH- -CD，

即 β 所得

H NMR

入

化学

= =

5． 92 ( d，J 6． 0 Hz，7 H) ，5． 82 ( s，7 H) ，4． 93 ( s，7 H) ，3． 68 ( t，J 6 Hz，7 H) ，

位移为 δ

= = =

3. 61( t，J 7．5 Hz，7 H) ，3．19( brd，J 15 Hz，7 H) ，2．77～2．74( m，7 H) ，2．13( t，J 6．0 Hz，7 H) ，

2。

如图

2．3

传感器的制备

0．30

0．05 m Al O

， 0．5 mmoL/L H SO

粉末打磨金电极用超纯水超声清洗后在中进行

分别用

和

( 0．35～ 1．50 V)

循环伏安扫描扫描电压! !

。 2 L 0．01 mol/L

直至获得可逆的循环伏安图将金电极浸入 "

SH- -CD

，4℃

2 h。

20 mmol/L Tris-HCl

( pH 7．4) ，

清洗氮气流下干

溶液中

燥再将电极浸泡在

用超纯水清洗后于氮气流下干燥即制得传感器

2．4

孵育

修饰后的电极用

缓冲液

，

3．0 10 mol/L

( 1∶ 1，V/V)

的溶液中

12 h，，

将适配体组装到电极表面

适配体乙醇

，

。

凝血酶的检测

Tris-HCl

，

缓冲液中将制备的适配体传感器用示差脉冲伏安法

( DPV) (

进行电位扫描扫描范围

在

0．2～0．6 V，

! 增量

0．001 V，

脉冲振幅

0．05 V，

扫描速率

0．002 V/s) ，。

记录峰电流的大小然后在缓冲液

，37℃

5 min

，

后测量

DPV ，

峰电流大小加入凝血酶前后峰电流变化的差值可用于

中加入凝血酶

下孵化

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